Η Αμβροσιανή Πινακοθήκη δημιουργήθηκε από το πάθος του καρδινάλιου Federico Borromeo (εξαδέλφου του αγίου και αρχιεπίσκοπου του Μιλάνου Κάρλο Μπορομέο), ο οποίος, από το 1595 μέχρι το θάνατό του, με τη μοναδική ευαισθησία του γνώστη και το πνεύμα του μεγάλου ουμανιστή, αφοσιώθηκε στη συλλογή ζωγραφικών έργων, γλυπτών και σχεδίων, τόσο παλαιότερων όσο και της εποχής του, δημιουργώντας με τον τρόπο αυτό μια εντυπωσιακή συλλογή έργων τέχνης.
Το μουσείο ιδρύθηκε και εγκαινιάστηκε για το κοινό από τον ίδιο τον καρδινάλιο, πριν από τέσσερις περίπου αιώνες, το 1618, με την επιθυμία η συλλογή αυτή να αποτελέσει πηγή έμπνευσης και μελέτης για κάθε καλλιτέχνη και φιλότεχνο. Στις αίθουσες του μουσείου, μπορεί κανείς να θαυμάσει έργα μεγάλων ιταλών καλλιτεχνών, όπως είναι οι Λεονάρντο ντα Βίντσι, Καραβάτζο, Μποτιτσέλι, αλλά και φλαμανδών ζωγράφων τους οποίους εκτιμούσε ιδιαίτερα ο Borromeo, όπως οι Γιάν Μπρέγκελ και Πάουλ Μπριλ.
Η Αμβροσιανή Πινακοθήκη φιλοξενεί, επίσης, μια από τις μεγαλύτερες συλλογές σχεδίων στον κόσμο, καθώς σε αυτή περιλαμβάνονται το τελικό προσχέδιο της "Σχολής των Αθηνών" του Ραφαήλ και ο "Codex Atlanticus" του Λεονάρντο.